特色水果酿酒发酵技术研究与应用

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获奖名称：

科技进步奖

获奖区域：

四川省

获奖等级：

二等奖

主要完成人：

左勇; 刘利平; 李东; 祁峰; 王国友; 李杨; 罗惠波; 卫春会; 边名鸿

关键词：

水果;  技术;  酿酒;  发酵;  发酵技术;  研究与应用;  水;  研究;  技术研究;  特色; 

第一完成单位：

四川理工学院

获奖时间：

2014

项目名称：

特色水果酿酒关键技术研究及产业化应用

联系人：

刘伟军;;左勇

联系电话：

0813-5506538

电子邮件：

kjc@suse.edu.cn

邮编：

地址：

四川省自贡市自流井区汇兴路学苑街180号

合作完成单位：

四川国友果业有限公司

单位电话：

0813-5505838

传真：

0813-5505837

网址：

推荐单位(专家)：

四川省教育厅

摘要：

2010年1月以来，四川理工学院与四川国友果业有限公司合作开展了特色水果酿酒发酵技术研究与应用的相关工作，于2011年获四川省教育厅成果转化培育专项（11ZZ016）“特色水果酿酒关键技术研究及产业化应用”项目资金支持，2013年11月顺利结题，获得优秀。本成果利用现代生物技术改造传统果酒生产，筛选出酿制果酒专用酵母，缩短了发酵时间，提高果酒风味和产量；通过使用本项目开发出的水果原料保存新方式，可延长果酒生产原料供给时间，进一步提高产量；利用果酒酿制后的废弃物提取色素，研发出绿色、天然、安全的食品色素；开发出果酒新品种。 主要内容 ①专用酿造果酒酵母的筛选与诱变。微生物菌种选育的关键技术，在筛选过程中，采用随机取样原则收集果实和果园土壤、自然发酵醪，进行筛选，并采用多种手段进行诱变育种，最后得到高产菌株。 ②发酵条件对产品品质的影响。根据筛选的优良菌株，研究发酵过程的控制参数，如糖添加量、酵母添加量、SO2添加量、温度、pH值发酵时间等条件进行优化选择。 ③果酒澄清及稳定性对果酒后期品质的影响。对果酒容易出现的生物稳定性及非生物稳定性的现象就行研究，避免此类情况的出现，并对果酒澄清条件及澄清剂进行优化选择，挑选最适合的澄清剂及澄清条件，保证果酒稳定性。 ④桑椹原料的处理情况对其果酒品质的影响。对不同原料酿制的桑椹果酒进行品质鉴定，挑选出最优的桑椹原料处理方式，选择最优的桑椹保存方式。 ⑤桑椹果酒酒渣中花青素鉴定及提取。采用纸层析法，鉴定了桑椹果酒酒渣中主要花色苷的结构，并利用BBD实验设计对多种花青素提取方式就行优化选择，挑选最优花青素提取方式。 技术关键 ①专用酿造果酒酵母的筛选与诱变。微生物菌种选育的关键技术，筛选效果将直接影响筛选的结果，直接影响能否得到高产菌株的发酵功能。因此，在筛选过程中，采用随机取样原则收集果实和果园土壤、自然发酵醪，进行筛选，并采用多种手段进行诱变育种，最后得到高产菌株。 通过一系列的分离、筛选、纯化以及发酵实验，选出了一株细胞活力高、起酵快、产酒率高、风味佳的桑椹果酒酿造酵母酒J。通过与对照组比较，表明该酵母菌完全可以取代葡萄酒干酵母用于桑椹果酒的发酵。在分离出的天然酵母菌酒J的基础上，使用紫外辐照方法的诱变筛选得到1株桑椹果酒发酵酵母A2，该酵母具有起酵速度快、产酒度高，平均酒精度达到10.3%(v/v)；而且果香、酒香浓烈，口感较好，果酒风味佳、澄清度高，是代替葡萄酒干酵母进行桑椹果酒发酵的理想选择。 通过富集、分离纯化和筛选，得到一株酵母菌Z20，其产酒和产香能力较好，且起酵快、发酵能力较好、产酒精率高且产香较好的无花果就专用酵母菌。该酵母菌具有一定的耐酸性、糖度耐受性、SO2耐受性以及一定的酒精耐受性。且该菌可以提高无花果酒的品质，可以取代葡糖酒酵母进行无花果酒发酵。从无花果果酒自然发酵筛选出的酵母Z20，通过紫外-微波诱变筛选出UV-5，其产酒精含量达13.6%Vol，结合感官评定结果，该诱变后酵母具有发酵速度快、产酒度高、高级醇含量适中，残糖量更少，且性状稳定，所产果酒澄清度高、风味佳、口感好，是代替葡萄酒干酵母进行无花果果酒发酵的理想选择。 ②果酒酿造酵母的鉴定。利用26S rDNA D1/D2序列分析法，对从桑椹酒中分离得到的10株、无花果酒中分离得到的12株酵母菌进行鉴定。分别提取DNA，经PCR扩增后，测定其26S rDNA D1/D2序列，并与基因库中序列进行比较。该实验方法实现了酵母菌种级水平鉴定，与传统方法相比具有简便、快速等优点，适合实验室及工业化生产中对酵母菌的鉴定。 使用25μL体系对目标序列进行PCR扩增，引物序列如下: 正向引物 NL- 1: 5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG- 3', 反向引物 NL- 4: 5'- GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3' 用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶对26S rDNA的PCR扩增产物作电泳检测，通过核酸染色剂溴化乙锭（EB）染色后，放在凝胶成像系统观察并照相。经检验后的10个桑椹酒酵母样品、12个无花果酒酵母样品PCR产物条带送至上海杰李生物工程有限公司测序，结果显示样品均测序成功。 将测序结果在GeneBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上的BLAST进行对比，结果显示与酵母菌26S rDNA序列呈现高度的同源性，根据Kuttzman&Robnet所规定的同种内不同菌株间差异一般不超过1%的标准，对桑椹果酒的10株、无花果酒的12 株酵母菌进行了注释。桑椹果酒的10株酵母菌中，1、5、10号样品为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；2、7号为柠檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）；3号样品为柠檬形假丝酵母（Candida apicola）；4、8号样品为葡萄汁有孢汉逊酵母 （Hanseniaspora uvarum）；6号样品为季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）；9号样品为戴尔有孢圆酵母( Torulaspora delbrueckii)。无花果酒的12 株酵母菌中，1、4、7、11号样品为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；2、6、9号样品为有孢汉逊酵母 （Hanseniaspora uvarum）；3、12号样品为柠檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）；5号样品为星形假丝酵母（Candida stellata）；8号样品为克鲁维毕赤氏酵母 （Pichia kluyveri）；10号样品为戴尔有孢圆酵母( Torulaspora delbrueckii)。 结果显示，桑椹酒和无花果酒的酵母均由酿酒酵母与非酿酒酵母组成。酿酒酵母，使发酵过程启动快，发酵能力强，发酵过程完全，残糖含量少，酒精含量高，酒体协调，酒质清淡，提高了生产效率，更好地控制了果酒发酵生产过程。非酿酒酵母对果酒的总体风味产生积极的影响，它们能在发酵过程中产生一些高级醇、低级脂肪酸和酯类等芳香物质和特别的风味成分，使酒的风味特征明显改善。此类酵母所产生的风味物质的种类和数量随其种属的不同而异，不同的产香、产酯酵母赋于果酒不同的风味特征。 ③发酵控制的研究。专用的酿造复合酵母必须有相应的生产工艺相配套，因此，在选育出专用酿造复合酵母的同时我们也应该对果酒发酵的工艺进行进一步的研究。对果酒工艺进行研究，通过菌种的筛选，再研究适宜果酒酿造加工工艺，以进一步提高果酒的风味和品质，降低产品成本，提高经济效益。 通过对桑椹果酒发酵工艺条件的研究，确定了其最佳发酵工艺为，糖度170g/L、SO2用量70mg/L、接种量0.9%、发酵温度为26℃，且不同因素对实验的影响程度为，发酵温度＞SO2用量＞接种量＞糖度。 通过单因素试验和正交试验，得出无花果酒发酵的最优条件为发酵温度20℃，糖度22%，接种量0.7%，SO2添加量60mg/L，pH为6。此条件下，无花果酒的酒精度能达到14.5%vol。温度和糖度对无花果酒酒精产率的影响非常显著，接种量的影响显著，pH和SO2添加量无显著影响。 ④果酒稳定性及澄清的研究。果酒酿制之后的果酒酒体澄清度与颜色不稳定，监测果酒酒体变化情况，分析引起果酒不稳定性的主要原因，并研究保质方法，为酿制稳定性好的果酒提供了技术保障。 桑椹果酒中SO2含量与果酒的稳定性密切相关，当SO2含量小于等于20 mg/L时，桑椹果酒出现铁破败病，当SO2含量大于等于60 mg/L时，桑椹果酒出现铜破败病，所以，当SO2含量在40 mg/L左右时可以增强桑椹果酒的稳定性，并且冷冻处理也可以适当提高桑椹果酒的稳定性。通过离心澄清、琼脂澄清、皂土澄清、明胶澄清、壳聚糖澄清等五种方法对无花果果酒进行澄清，并结合还原糖和总酸的保存率以及澄清效果综合指标，确定无花果果酒的最佳澄清工艺为壳聚糖澄清，壳聚糖用量为1.2g/L。通过冷热处理，并且通过静置实验，澄清后的无花果果酒不添加任何稳定剂的情况下，具有一定的稳定性，能保存较长时间。 ⑤不同原料酿造过程中果酒品质的变化。在酿制过程中不同原料酿制的桑椹果酒变化情况也有不同，分析整个过程果酒品质变化，挑选最优酿制桑椹果酒原料，选取最优的桑椹果酒保存方法，打破季节性缺陷。 通过发酵过程中理化指标比较，冻桑椹酿制的果酒所含的活性物质如黄酮类、多酚类、花色苷的含量与鲜桑椹中的含量差别不大，其酒精含量、总糖含量、色度色调、黄酮含量、多酚含量、花色苷含量分别为12.9v/v、5.4“BX、2.157、0.825、11.816 mg/L、178.4（100mg/L）、11.851 mg/L。和其他处理方式的原料相比，以冻桑椹酿为原料进行发酵，果酒中的酒精含量以及活性物质的含量能够较早的达到稳定状态，可缩短发酵周期。同时，将桑椹进行冷冻保藏，不但可以保证期果酒的品质，而且还可以延长桑椹原料供给时间，克服了桑椹果酒生产受季节的限制，为生产提高产量创造了条件。 不仅从挥发性风味物质的种类，而且从挥发性风味物质的含量上来看冻桑椹与新鲜桑椹酿制的桑椹果酒的品质为最佳，比较冻桑椹与新鲜桑椹酿制的桑椹果酒挥发性风味物质的种类及含量都类似，所以利用冷藏的方式对桑椹就行保藏为最佳的保藏方式。 ⑥桑椹果酒酒渣中花青素鉴定及提取。桑椹果酒酒糟在很多企业作为废物弃用，其中含有大量的花青素没有得到充分利用，不但浪费资源，而且造成很大的环境污染，因此，从桑椹果酒酒糟中提取花青素，具有较大的经济效益和社会效益。 采用溶剂浸提法对桑椹果酒酒糟中的花色素进行提取，在单因素试验的基础上，采用BBD（Box-Behnken Design）设计法设计进行3因素3水平的响应面分析试验对花色素的提取工艺进行了优化。影响花色素提取量因素的优先次序为：B（提取温度）＞C（固液比）＞A（提取时间）。优化后最佳提取工艺为：取时间150.3（min），提取温度80（℃），固液比1:20（g/mL）。 微波具有选择性和穿透力强、加热效率高等特点，采用微波辅助提取法提取桑椹果酒酒糟中花青素效果较好，各种因素对提取效果的影响程度依次为提取时间、溶剂中乙醇浓度、固液比，最佳提取条件为：溶剂为0.1%HCl-55%乙醇溶液、提取时间267（s）、固液比1:30（g/mL），此条件下色素提取量为2.098mg/g。 将Plackett-Burman设计与Box-Behnken设计相结合，有效、快速地优化出超声波辅助提取桑椹果酒酒糟中花青素的最佳提取条件为：含0.1%HCl的77%乙醇溶液作为提取剂，超声时间120（min），固液比1:24（g/mL），超声温度50℃，超声波功率400W，此条件下花青素提取量为2.392 mg/g。优化得到的预测结果与实际实验得到的结果吻合也较好。影响花青素提取效果因素的顺序为：固液比>提取剂中乙醇浓度>超声时间>超声温度>超声功率。 技术指标 通过将本研究成果应用于果酒生产企业，提高了果酒出产率15%，缩短果酒发酵周期10～20%的时间，实现节能降耗近30%，提高了果酒的质量和市场竞争能力。