蜂产品质量与安全关键技术研究

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获奖名称：

科学技术奖

获奖区域：

江苏省

获奖等级：

三等奖

主要完成人：

吴斌; 张睿; 丁涛; 沈崇钰; 陈惠兰; 陶宏锦; 张晓燕; 赵增运; 陈磊; 费晓庆; 蒋原

关键词：

关键;  技术;  关键技术;  产品;  蜂产品;  质量;  产品质量;  品质;  研究;  技术研究; 

第一完成单位：

江苏出入境检验检疫局

获奖时间：

2011

项目名称：

蜂产品质量与安全关键技术研究

联系人：

动植物与食品检测中心

联系电话：

025-52345188

电子邮件：

邮编：

地址：

江苏省南京市白下区中华路99号

合作完成单位：

单位电话：

025-52345187;52345103

传真：

025-52345110

网址：

推荐单位(专家)：

中华人民共和国江苏出入境检验检疫局

摘要：

一、立项背景 中国是世界第一养蜂大国，年产蜂蜜约20万吨、蜂王浆1000吨，年创汇1亿多美元，蜂群数量和主要蜂产品出口均居世界第一。然而中国蜂产品质量安全近10年来却一直存在诸多质量安全问题和风险隐患。最为突出的2个问题是：(1)有害物质残留；(2)人为掺假。 从2002年开始，欧盟、日本和美国纷纷对中国出口蜂蜜发难，抗生素残留技术壁垒的出现导致中国蜂产品每年出口损失达数千万美元。该现象背后不仅揭示出中国蜂产品质量上客观存在的问题，更暴露出中国在相关标准检测方法上的严重缺失，导致监管无据可依。近几年，随着央视等主流媒体相继披露一些不法商贩从事蜂蜜和蜂胶掺假的非法活动谋取暴利，中国蜂产品质量安全问题又一次被推上了风口浪尖，然而对应的掺假鉴别标准方法的缺失再一次导致大量问题产品流入国内市场甚至流向国际市场，以蜂蜜为例：国内一年蜂蜜产量约20万吨，每年出口量就有10万吨，加上国内销售超过30万吨，实际一年的蜂蜜销量超过40万吨，其中有约20万吨的不同糖浆掺入蜂蜜进行造假，糖浆和蜂蜜之间的价格差异带来的不法商业利益超过10亿人民币。巨大的隐患导致中国整个蜂产品行业处于岌岌可危的状态。 该项目针对蜂产品中最为突出的各类有害残留物质和人为造假两个质量安全问题进行了系统的研究，推出了一系列标准方法和应用成果，其意义有以下三点： (1)有利于提高蜂产品质量，保障民众健康和权益，杜绝违法违规行为。蜂产品中的药物残留会通过食物链进入人体，对人体产生副作用；掺入各种糖浆的蜂蜜和杨树胶的蜂胶对人体的保健功效方面远不及真正的蜂蜜和蜂胶，损害了普通消费者和中国蜂产品行业的权益和名誉。新标准建立，有利于督促蜂产品生产企业提高产品质量，杜绝违法违规行为，净化中国蜂产品行业，最终保障普通消费者健康和权益。 (2)有利于促进国际贸易，提升中国蜂产品行业在世界范围内的竞争力。我国是蜂产品出口大国，但近年来欧盟、日本、美国等蜂产品主要进口国针对我国蜂产品实施技术性贸易壁垒，在增加蜂产品检测项目的同时，不断降低药物残留的允许限量，使我国蜂产品出口严重受阻。对蜂产品特别是原料中的药物残留进行检测，不但保证了产品的质量，而且避免了不合格产品的出口，降低了出口风险，减小了技术性贸易壁垒对蜂产品出口贸易的影响。 (3)促进农产品增收，为三农问题的解决提供新的发展思路。世界上主要农作物的85%都依赖于蜜蜂等昆虫授粉，尤其是油料作物、蔬菜类和水果类，在农业生产中蜜蜂授粉可以提高农作物产量，减少化学农药的使用，改善农田的生态环境，所以蜜蜂授粉在农业生产中占据十分重要的作用，掺杂造假的存在，使市场上的蜂蜜价格背离了真正的价值，严重损害了蜂农的利益，也使得这几年国内的蜂群减少，农业生产间接受到一定的影响。系列标准和方法的建立，有利于促进养蜂业的健康发展，进而通过蜜蜂授粉减少化学药物的使用，改善生态环境，保证农作物的高产优质，为三农问题的解决提供新的发展思路。 二、详细科学技术内容 创新点一、分析化学 建立了蜂王浆中多种兽药残留的检测方法，转化为5个国家标准、1个行业标准、6篇论文和1项技术转让 国家标准： 1.GB/T 21164-2007 蜂王浆中链霉素、双氢链霉素残留量测定方法 液相色谱法 2.GB/T 21167-2007 蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定方法 液相色谱—串联质谱法 3.GB/T 23407-2009 蜂王浆中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法 4.GB/T 23409-2009 蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法 5.GB/T 23411-2009 蜂王浆中17种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法 行业标准： SN/T 2538-2010 进出口动物源性食品中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶残留量的检测方法 液相色谱—质谱/质谱法 论文： 1.Determination of chloramphenicol in royal jelly by liquid chromatography-tandem mass spectrometry,Journal of AOAC international,2006,89(5):1432. 2.Analysis of tetracycline residues in royal jelly by liquid chromatography-tandem mass spectrometry,Journal of Chromatography B,2008,868:42. 3.Determination of three nitroimidazole residues in royal jelly by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,Chinese Journal of Chromatography,2006,24(4):331. 4.高效液相色谱—串联质谱联用测定蜂王浆中三种硝基咪唑类残留，色谱，2006,24(4):331. 5.高效液相色谱—串联质谱联用测定蜂王浆中四种硝基呋喃类药物的代谢物，色谱，2006,24(5):432. 6.高效液相色谱柱后衍生法测定蜂王浆中的链霉素，色谱，2008,26(3):395. 样品的复杂性是导致残留分析复杂化的根源，药物在蜂王浆中回收率较低的原因可能是蜂王浆中的某些蛋白与药物结合较强。要提高回收率，必须破坏这种结合，使药物释放出来。因此，选择了三氯乙酸、三氯甲烷、醋酸铅等作为蛋白沉淀剂，或者以氢氧化钠使蛋白变性，从而将药物从蛋白中释放出来。在此基础上结合净化技术，通过液液萃取、固相萃取等方式净化样品，制成适合仪器分析的样品，主要通过液相色谱质谱联用仪对样品中的药物残留进行定性、定量分析，均得到了满意的回收率，达到国内外检测限量的要求。 技术转让： 《关于蜂王浆样品处理技术转让合同》 国内首次研发出蜂王浆中氯霉素的提取技术，并于2006年将该技术转让给德国拜发公司(R-Biopharm AG)。拜发公司销售的氯霉素试剂盒中有关蜂王浆提取技术说明书中都附有我方实验室标志(Logo)。 创新点二、分析化学 建立了蜂蜜中多种兽药残留的检测方法，并转化为5个国家标准、7篇论文、1个专利和1项技术转让 国家标准： 1.GB/T 21168-2007 蜂蜜中泰乐菌素残留量的测定方法 液相色谱—串联质谱法 2.GB/T 21169-2007 蜂蜜中双甲脒及其代谢物残留量测定方法 液相色谱法 3.GB/T 23408-2009 蜂蜜中大环内酯类药物残留量测定 液相色谱—质谱/质谱法 4.GB/T 23410-2009 蜂蜜中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法 5.GB/T 23412-2009 蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留量的测定方法 液相色谱—质谱/质谱法 论文： 1.Determination of tetracyclines in honey using liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection and residue confirmation by mass spectrometry,Chinese Journal of Chemistry,2007,25:1. 2.高效液相色谱—电喷雾多级质谱联用测定蜂产品中氯霉素残留，检验检疫科学，2003,13(6):26. 3.高效液相色谱—串联质谱联用测定蜂蜜中3种硝基咪唑类残留，分析化学，2008,34(8):1206. 4.高效液相色谱—电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中的林可胺类抗生素残留，色谱，2006,24(5):436. 5.高效液相色谱—串联质谱法测定蜂蜜中残留的19种喹诺酮类药物，色谱，2009,27(1):34. 6.高效液相色谱—电喷雾串联质谱测定蜂蜜中8种大环内酯类药物残留，分析化学，2007,35(2):166. 7.高效液相色谱法测定蜂蜜中的双甲脒残留，中国养蜂，2005,56(5):4. 专利： 蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，200810195887 蜂蜜的成分主要为葡萄糖、果糖等糖类，在提取时选择含水较多的溶液作为提取溶剂，在提取目标物的同时溶解蜂蜜中的各种糖，进而在前处理过程中通过净化除去这些糖类，主要采用了液液萃取和固相萃取的方式将目标物从水溶液中转移到有机溶剂中，同时除去了蜂蜜样品中的糖类。通过液相色谱仪和液相色谱质谱联用仪对样品中的药物残留进行定性、定量分析，获得了满意的回收率。 技术转让： 《关于统一检测方法的协议》 蜂产品中多种抗生素残留检测技术在新日本检定协会(SK)的多次现场和盲样验证后，得到认可，最终于2008年将该系统检测技术以技术转让费的形式转让给新日本检定协会(SK)。我方实验室作为新日本检定协会(SK)指定实验室对其进口样品进行检测。 创新点三、分析化学 建立了蜂蜜、蜂胶掺假的系列鉴别方法，并转化为5个行业标准（已完成报批） 1.出口蜂胶中杨树胶的鉴别 液相色谱—飞行时间质谱法 2011B155 2.出口蜂蜜中大米糖浆的鉴别 液相色谱—质谱/质谱法 2011B152 3.出口蜂蜜中大米特异基因的检测方法 实时荧光PCR法 2011B153 4.出口蜂蜜中稳定碳同位素比值的测定 液相色谱—元素分析—同位素比值质谱联用法 2011B154 5.出口蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶的测定方法 2010B131 搜集不同种类的纯正蜂蜜以及不同区域、不同品牌的真蜂胶以及蜂蜜、蜂胶的掺入物，利用化学方法和生物方法等分析掺假蜂蜜、蜂胶与纯正蜂蜜、蜂胶的差别。利用液相色谱质谱联用仪、液相色谱—飞行时间质谱仪以及实时荧光定量PCR法分析真假蜂产品，找出其中的特征物质，根据两者差别来进行鉴别；利用液相色谱—稳定同位素质谱仪(LC-IRMS)，先将蜂蜜中的各种糖通过液相色谱分离，在分别测定各种糖的碳同位素比值，根据同位素数据库来判断蜂蜜是否掺假；此外还对蜂蜜中的外来酶进行研究，通过液相色谱法测定酶与底物反应后的产物，间接测定蜂蜜中外来酶的含量，进而判断蜂蜜是否掺假。以上5个行业标准为紧急立项，时间紧、任务重，目前已通过审定，进入报批阶段，该方法对打击蜂产品的掺杂使假具有重要意义。 创新点四、分析化学 建立了蜂蜜、花粉、蜂胶等蜂产品中重金属残留的检测方法，并转化为2个国家标准和1篇论文 国家标准： 1.GB/T 23869-2009 花粉中总汞的测定方法 2.GB/T 23870-2009 蜂胶中铅的测定 微波消解—石墨炉原子吸收分光光度法 论文： 石墨炉原子吸收直接测定蜂蜜中铅，食品科学，2008,29(3):423. 蜂蜜由于有较好的水溶性，将其溶于水后，采用基体改进剂直接用石墨炉原子吸收分光光度法测定，避免了操作繁琐的湿法或干法消化，具有操作简单、回收率高、精密度好的优点。但花粉和蜂胶由于成分比较复杂，前处理过程中必须经过消解处理。样品处理采用了微波消解，提高了消解效率，采用原子荧光光度计和石墨炉原子吸收分光光度计分别测定样品中的汞和铅的含量，方法均得到了较好回收率和精密度。 创新点五、分析化学 建立了蜂产品中农药苯醚甲环唑残留的检测方法，并转化为1个行业标准 SN/T 1975-2007 进出口食品中苯醚甲环唑残留量的检验方法 气相色谱—质谱法 样品用有机溶剂提取后，采用弗罗里硅土固相萃取小柱净化提取液，采用气相色谱—质谱联用仪测定苯醚甲环唑的含量，该方法操作简单，回收率较好。 创新点六、分析化学 建立了蜂产品中外来添加物环己基氨基磺酸钠的检测方法，并转化为1个国家标准 GB/T 23405-2009 蜂产品中环己基氨基磺酸钠的测定 液相色谱—质谱/质谱法 蜂蜜样品直接用盐酸溶液溶解，而蜂王浆样品由于富含蛋白质，需要先用乙腈将蛋白沉淀，用盐酸溶液溶解后采用固相萃取方式将样品溶液富集。由于环己基氨基磺酸钠在HLB小柱上不保留，选择了弱阴离子交换柱，采用液相色谱—串联质谱法对目标物定性、定量分析，相比于传统的衍生后用液相色谱—紫外检测器检测方法，简化了操作，减少了干扰，并提高了回收率。 创新点七、分析化学 以研发标准为依托，组织了2010年全国质检系统、卫生部系统、农业系统和国内外蜂产品相关第三方检测机构及企业的蜂产品能力验证（蜂蜜中喹诺酮类药物残留测定 CNCA-10-A01）和多次开展全国性有机蜂蜜抽检 受国家认监委委托，开展2010年能力验证项目“蜂蜜中喹诺酮类药物残留测定”，该项目具有广泛代表性，并邀请到国外实验室参与，收集到蜂蜜中喹诺酮类药物检测的大量信息。该能力验证以本项目输出的“GB/T 23412-2009 蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留量的测定方法 液相色谱—质谱/质谱法”国家标准方法进行检测，其结果有助于了解我国相关实验室对蜂蜜中喹诺酮类药物残留检测的能力水平，对提高实验室检测水平，也为我国蜂蜜进出口贸易提供了技术参考。在2010年和2011年全国性有机蜂蜜的抽检工作中，利用本项目的制定的标准方法对蜂蜜中的喹诺酮类、磺胺类、硝基咪唑类药物残留进行了检测。2010年共抽查了13个省份36家企业的36批次样品，该抽检工作为了解我国有机蜂产品的概况提供了依据，并有助于指导养蜂业合理用药，促进我国蜂蜜产业的健康发展。 三、与国内外同类技术的综合比较 通过国家一级查新中心南京农业大学查新站以及以下搜索引擎进行文献检索： (1)美国化学文摘(CA)；(2)Web of Science；(3)Elsevier；(4)美国和欧洲专利库；(5)国家标准方法库；(5)CNKI学术期刊；(6)维普中文科技期刊数据库，检索关键词有：蜂产品、残留、检测、掺假。 经过检索和比较同类技术发现： 目前对动物源性食品中药物残留检测的方法比较多，包括硝基呋喃类及其代谢物、硝基咪唑类及其代谢物、四环素族、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、青霉素类和氨基糖苷类以及铅、汞等有害金属的多种检测方法。 国内外目前很少有针对蜂产品中各类有害物质残留检测的方法。尽管有零散的针对个别有害物质，如硝基呋喃类代谢物、氯霉素、氨基糖苷类、磺胺类药物的测定方法，但是系统的研究蜂产品中各类有害物质残留检测的方法还没有任何报道。 目前国内外已经开始对蜂产品的掺假进行研究，但相关文献较少，特别是对真假蜂蜜、蜂胶中特征物质的研究，国内外还没有任何报道。 由于蜂产品基质复杂，所以前处理很关键。在我们的方法中，根据不同药物的理化性质，结合蜂产品基质的特点，进行了系统的研究，取得了较好的效果，多种有害物质残留的检测方法以及蜂产品的掺假鉴别方法都属于国内外首次报道。