我国四种主要果树的病毒分离鉴定及检测技术体系研究

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获奖名称：

科技进步奖

获奖区域：

湖北省

获奖等级：

二等奖

主要完成人：

王国平; 洪霓; 丁芳; 徐章逸; 郑银英; 张建坤; 徐文兴; 王彩霞; 王利平; 邓晓云; 侯雨萱; 刘永清

关键词：

检测技术;  鉴定;  技术;  树;  检测;  技术体系;  分离鉴定;  病毒分离;  果树;  分离;  体系研究;  体系;  病毒分离鉴定;  研究;  我国;  病毒; 

第一完成单位：

华中农业大学

获奖时间：

2007

项目名称：

柑橘病毒快速诊断试剂盒研制与技术体系建立

联系人：

王宏杰

联系电话：

027-87282038

电子邮件：

邮编：

地址：

湖北省武汉市南湖狮子山

合作完成单位：

单位电话：

027-87282038;87282027

传真：

027-87384670

网址：

推荐单位(专家)：

华中农业大学

摘要：

　　本项目研究来源于湖北省科技攻关计划项目《柑橘病毒快速诊断试剂盒研制与技术体系建立》（2006AA203B05）、湖北省自然科学基金优秀研究团队项目《农业动植物病虫害防治的微生物学研究》（2003ABA195）、湖北省自然科学基金优秀研究团队项目《柑橘等果树生物技术与品种改良技术的研究》（2005ABC001）、湖北省自然科学基金《双链RNA诱导对苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒抗性研究》（2006ABA162）、农业部“引进国际先进农业科学技术”专项资金项目《果树病毒快速检测特殊材料及配套技术》（2001-222）、国家高技术研究发展计划（863计划）子课题《主要果树新优品种脱毒苗高效快繁技术研究》（2001AA241142），项目起止时间2001年1月至2006年12月。取得以下主要成果： 　　1、在国内从4种主要果树上首次鉴定出14种病毒及类似病原，并在国际上首次在黄皮、柠檬上发现柑橘黄龙病病原。从湖北、广东、江西、海南、湖南、浙江、重庆、广西、北京、辽宁、河南等11个省市的砂梨、柑橘、葡萄及桃样品上，鉴定出病毒11种、类病毒2种和韧皮部杆菌1种，其中砂梨3种、柑橘4种、葡萄5种及桃2种。鉴定出的病毒种类为：苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果茎痘病毒（ASPV）、柑橘速衰病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、葡萄卷叶相关病毒1,2,3,7(GLRaV-1,2,3,7)、葡萄斑点病毒（GFkV）；鉴定出的类病毒种类为柑橘裂皮类病毒（CEVd）和桃潜隐花叶类病毒(PLMVd)；在柑橘上鉴定出的韧皮部杆菌为柑橘黄龙病(HLB)韧皮部杆菌(Candidatus Liberobacter asiaticus)，并在黄皮、柠檬表现斑驳症状的病株上发现柑橘黄龙病病原。 　　2、在国内首次对CTV、CEVd、GLRaV-2、PLMVd等9种病毒及类病毒的基因组全部或部分核苷酸序列进行了分析，在GenBank上新登陆了30余个基因组全部或部分核苷酸序列，在国际上报道了一些新的分离物。分离CTV、GLRaV-2、GLRaV-2、ACLSV、ASGV等7种病毒并系统地研究了所分离出的病毒的生物学、血清学及分子生物学特性；在国内首次对CTV、CEVd、GLRaV-2、PLMVd等9种病毒及类病毒的基因组全部或部分核苷酸序列进行了分析；并通过序列分析和单链构象多态性(SSCP)比较，对不同来源的病毒和类病毒进行了分子变异研究，为明确病毒和类病毒在不同生态条件下的不同分子特性与致病表现的关系及阐明其分子致病机理提供了很有参考价值的实验依据。 　　3、在国内首次研制出5种果树病毒和2种果树类病毒的具有自主知识产权的17种诊断试剂。制备了针对中国CTV、ACLSV、ASGV分离物的多克隆抗体和CTV单克隆抗体，CTV6种单克隆抗体效价为1∶25600～51200；研制出ACLSV、ASGV、PLMVd、CEVd等4种病毒和类病毒生物素标记的特异探针；生物合成了GLRaV-2和GLRaV-3外壳蛋白（CP）和复制酶（RdRp）基因原核表达重组融合蛋白多克隆抗体，GLRaV-2重组RdRp和重组CP制备的抗血清效价均为1∶25600，GLRaV-3重组CP制备的抗血清效价为1:51200。 　　、研究建立了砂梨、柑橘、葡萄及桃上9种病毒的6种血清学检测方法，12种病毒及类似病原的6种分子生物学检测方法，柑橘3种病原的同步检测技术体系。研究了ACLSV、ASGV、ASPV、GLRaV-1,2,3,7、GFkV、CTV的ELISA、组织免疫印迹法（DTBIA）、双抗体夹心法(DAS-ELISA)、A蛋白酶联法(PAS-ELISA)、三抗体夹心法(TAS-ELISA)、Dot-ELISA检测方法，并研究表明，DTBIA不仅可作为果树病毒的一种快速、灵敏、准确的检测方法，而且可对果树病毒在寄主组织中的分布进行定位；研究了上述9种病毒和CEVd、PLMVd及HLB病原的PCR、RT-PCR、免疫捕捉（IC-）RT-PCR、试管免疫捕捉(TC-)RT-PCR、巢式(Nested-)PCR等分子生物学检测方法；并研究建立了柑橘CTV、CEVd和HLB病原同步检测（多重RT-PCR）技术体系，其灵敏度达到10pg总RNA，其中CTV达到1pg。 　　5、在中国农科院果树研究所等单位推广应用，完成2200份样品的病毒检测，获得49个优良品种的197株无病毒母本树。使我国主要果树的病毒检测由原来的以生物学鉴定为主改变为目前的以血清学和分子生物学鉴定为主，病毒鉴定时间由目前的田间鉴定1～1.5年和温室鉴定的6～8个月，缩短为1～2天；检测数量由原来的150～200个样品/年，增加到8000～10000个样品/月，且原来的生物学鉴定一年只能进行一次，而目前的血清学和分子生物学鉴定一年四季均可进行。使我国主要果树脱毒率由原来的20～30%增加目前的到50～60%；无病毒种苗繁殖速率由原来的1:20增加到目前的1:800～1000。