荔枝、龙眼、香蕉种质资源的分子评价与分类研究

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获奖名称：

科学技术奖

获奖区域：

广东省

获奖等级：

三等奖

主要完成人：

易干军; 霍合强; 张秋明; 于晓英; 谭卫萍; 李典范; 陈大成; 黄自然; 蔡长河; 黄秉智; 李建光; 邱燕萍; 曾继吾; 周碧容; 吴元立

关键词：

种质资源;  分子;  香蕉;  分子评价;  眼;  龙眼;  种质;  资源;  研究;  分类;  评价;  分类研究;  荔枝; 

第一完成单位：

广东省农业科学院果树研究所

获奖时间：

2005

项目名称：

联系人：

易干军

联系电话：

020-38765869;38765510

电子邮件：

yiganjun@vip.163.com

邮编：

地址：

广东省广州市天河区大丰二街80号

合作完成单位：

单位电话：

020-38765510

传真：

020-38765626

网址：

推荐单位(专家)：

广东省农业科学院

摘要：

　　本研究应用AFLP技术，从分子水平上研究了荔枝、龙眼、香蕉种质资源的遗传多样性；对部份荔枝、龙眼、香蕉种质资源进行分子分类与评价，建立起荔枝、龙眼、香蕉主要品种（系）分子标记标准图谱；为配合品种认定工作，对仙婆果荔枝、红绣球荔枝、春甜桔大果新株系进行了鉴定；为更有效的保存和利用荔枝、龙眼、香蕉种质资源及品种的登记、保护、鉴定等提供了技术支持和理论依据。经多年研究，超额完成了合同计划任务。主要研究结果如下： 1、建立起荔枝、龙眼、香蕉AFLP分析体系。 （1）DNA的提取。 　　荔枝DNA的提取：应用10m mol/L的抗氧化剂Na_2S_2O_5可以有效地防止荔枝叶片DNA提取过程中产生褐变。用改进后的CTAB法获得的HMW基因组DNA可用于荔枝AFLP分析。龙眼DNA的提取：改良常规的CTAB和SDS法提取龙眼叶片DNA，在提取液和裂解液中都加入抗氧化剂，并依材料不同新鲜度提出不同抗氧化剂浓度组合。成功地抑制了龙眼DNA的褐化，有效地除去了次生代谢物质，获得了完全适合于AFLP分析的龙眼DNA模板。香蕉DNA的提取：在运用AFLP技术进行香蕉种质资源的鉴别与分类时，成功的关键之一是HMW基因组DNA的成功制备和避免降解，为了获得高纯度的HMW香蕉模板DNA和清晰的AFLP指纹图谱，以香蕉为试材进行了用不同方法，从不同植物体部位提取香蕉DNA的研究。结果表明，以香蕉未展开的幼叶，成熟叶，新根为材料提取的DNA量足以进行AFLP分析，但考虑到取材的方便性，最好选用未展开的幼叶或成熟叶；用改进后的SDS、CTAB法均可获得HMW基因组DNA和AFLP指纹图谱，SDS法（用氯仿-异戊醇溶液抽提3次）提取的DNA量将近是CTAB法提取的DNA量的2倍，但SDS法提取的DNA纯度不如CTAB法提取的高。两种方法提取的DNA片段大小一致，大约在16kb左右，两种方法提取的DNA均可直接用于AFLP分析。 （2）对AFLP分析过程中的影响因子（酶切与连接、同位素标记与放射自显影）进行了研究。 双酶切必须完全彻底，酶切之后必须马上连接。4℃下显影时间以25min较为适当，并需根据同位素放射性的强弱，相应的延长或缩短显影时间。筛选出适于荔枝AFLP分析的最佳引物组合3对，分别为EcoRI AAC+MseI CTG，EcoRI AGC+MseI CAT，EcoRI ACC+MseI CAT；筛选出适于香蕉AFLP分析的最佳引物组合3对，分别为EcoRI ACC+MseI CAG，EcoRI ACC+MseI CAT，EcoRI AAC+MseI CAT。筛选出适于龙眼AFLP分析的两对引物组合，分别为EcoRI ACT+MseI CTT和EcoRI ACT+MseI CTC。建立的荔枝、龙眼、香蕉AFLP分析体系可直接用于荔枝、龙眼、香蕉AFLP分析。AFLP分析结果稳定、重复性好、多态性丰富，是进行果树品种鉴别及起源分类研究的良好方法。 2、荔枝种质资源的分子评价 对39份荔枝种质资源的遗传多样性研究结果表明：在分子水平上，荔枝品种之间的遗传多样性并非形态学性状所体现的那样丰富。最大部分荔枝品种之间的相似系数都在0.7以上，最高达0.97，其多态性带比例介于0.1698（布袋）和0.5943（元寿红）之间，其中大多数品种介于0.39-0.53之间，表明在分子水平上，荔枝品种之间的遗传多样性并非形态学性状所体现的那样丰富。 在分子水平上将39个荔枝品种分成了6组。第一组：三月红。第二组：包括糯米糍、七月熟、尚书怀、雪怀子、乌叶舅、麻雀春、鉴江红糯、高州糖驳、及第、下番枝、称驼、怀枝、兰竹、惠东四季荔、玉麒麟、将军荔、桂味（大核）、桂味（小核）、禾虾串、黑面登、中山脆肉、新兴香荔、禾角。第三组：包括八宝香、甜岩2号。第四组：包括元阳1号、黑叶、水东、元寿红、上番枝、宋香、无核荔、赤叶、妃子笑、白蜡、乌叶。第五组：乌面。第六组：布袋。与传统的以果皮龟裂片隆起类型作为分类标准的分类方法没有一致性，说明仅以果皮龟裂片隆起类型作为荔枝品种分类依据是不够的，本研究结果可以作为荔枝分类研究的依据与基础。 3、香蕉种质资源的分子评价 （1）在分子水平上依0.64的相似系数水平，可将供试的32个品种聚为6个独立群体，其中包括3个分别由单一品种组成的群体，依相似系数0.70的水平，又可以将群体Ⅰ（大蕉）划分为3个品种群，将粉蕉划分为3个品种群，将龙牙蕉划分为2个不同的品种群，其独立群体及品种群的组成为：群体Ⅰ（大蕉）：包括品种群Ⅰ（矮大蕉），品种群Ⅱ（海南芭蕉、木棉蕉、海南大蕉、高脚大蕉、畦头大蕉、偏蕉），品种群Ⅲ（牛角蕉）；群体Ⅱ（粉蕉）：包括品种亚群Ⅰ（小黑芭蕉、孟加拉绿蕉、冯粉、汕粉、叶大粗、番禺四倍体、大粉、金山大蕉、孟引82-9、Horm），品种群Ⅱ（高要粉），品种群体Ⅲ（鸡蕉、广东四倍体）；群体Ⅲ（龙芽蕉）：包括品种群Ⅰ（紫茎蕉、龙64-1、河口龙牙、金手指、夫人指蕉、孟加拉龙牙、绿孟龙），品种群Ⅱ（中山龙牙）；群体Ⅳ（酸大蕉）；群体Ⅴ（孟变）；群体Ⅵ（千旁倍）。在品种群内部，还可以根据一定的相似系数水平，将其划分为不同的品种群。 在对粉蕉、大蕉以及龙牙蕉等品种的分类时，Simmonds的形态学分类方法可以作为参照，但是该分类系统远不能反映粉大蕉、龙牙蕉类品种之间的亲缘关系及其演化规律。本文得到的研究结果显示粉蕉、大蕉以及龙牙蕉等各个品种之间存在丰富的遗传多样性，仅仅简单地将其划分为AAB或ABB等，都不能反映品种之间亲缘关系；粉蕉与大蕉两个类群之间遗传距离差异明显，将其简单归为ABB类型是不妥当的。这也是Simmonds分类方法的局限所在。 （2）采用AFLP技术，对35个香牙蕉品种（系）进行了鉴别与分类。从AFLP试剂盒所提供的64对引物组合中选取两对引物组合EcorIACC+MseICAT和EcoRIACC+MseICAG对35份香牙蕉材料进行了AFLP分析，共得到扩增位点107个，其中多态性位点84个，多态性位点比例达到78.5%，对35个品种的区分率达到100%。各品种（系）多态性带数存在差别，多态性带数最多为海南红蕉（56条），多态性比例最高为0.6667，可见其杂合程度较高；多态性带最少的为大丰1-1号（33条），其多态性比例为0.3929。各品种（系）相互之间其相似系数介于0.71-1.00，表明香牙蕉品种（系）之间遗传关系相对较近。 依相似系数0.88的水平，可以将供试的35个香牙蕉品种（单株）分为6个品种群。各群的具体情况如下：品种群Ⅰ：包括CO-1、龙优、大丰1号以及大果63-1等四个品种。品种群Ⅱ：包括海南岛红蕉、海南岛红蕉2号等两个品种。品种群Ⅲ：包括龙选1个品种。品种群Ⅳ：包括东S-1、台a、索4、大叶青3号、4-1、大丰1-4、万丰、仙人蕉、云南矮、德选、油蕉、8818、大种高把、阳江矮、几内亚、苹果、荷兰、东里蕉、B2号、德2、番粗、广西矮、巴西蕉、泰国蕉。品种群Ⅴ：滑蕉。品种群Ⅵ：大丰1-1号、坦桑尼亚。 鉴别了3个引自不同国家的品种：几内亚、苹果以及阳江矮实际上为同一个香牙蕉品种。本研究结果基于AFLP分子标记，能从分子水平上反映香牙蕉地方品种之间的亲缘关系，可以作为香牙蕉品种（系）分类的依据。 （3）在分子水平上，香蕉植物存在丰富的遗传多样性。可以将50个香蕉品种划分为四个群体，分别为群Ⅰ（香牙蕉）、群Ⅱ（包括龙牙蕉亚群及粉蕉亚群）、群Ⅲ（大蕉）、群Ⅳ（酸大蕉）。值得注意的是酸大蕉在本聚类图中单独归为群Ⅳ，龙牙蕉及粉蕉同属群Ⅱ。这一结果进一步显示Simmonds分类法主要是依形态学性状进行量化分类，其局限性是非常明显的。 4、龙眼种质资源的分子评价 对46个龙眼品种（系）间的亲缘关系及其遗传多样性进行了探讨。选用两对引物组合EcoRI ACT+MseI CTT和EcoRI ACT+MseI CTC对46份龙眼材料进行AFLP分析，共得到扩增位点111个，其中多态性位点103个，多态性比例达92.69%，区分率达100%。对AFLP扩增结果进行聚类分析，依相似系数0.76的水平可将46份龙眼品种（系）分为11个品种群。品种群Ⅰ：包括赤壳软。品种群Ⅱ：早禾石硖、大乌圆、新滘乌圆 乌圆、古山二号、水南一号。品种群Ⅲ：第一组：石硖、脆肉、顺德十叶、青壳石硖、陕西脆肉、储良、青皮、新滘大乌圆、荔枝种、宴中龙眼、旺高堂广眼。第二组：罗伞木、鸡蛋龙眼、沙梨肉、水眼、迟龙眼、鸡肾眼、台山龙眼、河洞广眼、迟龙眼2号。第三组：从化大个圆、卷叶、九月乌、南湖焦核、福建东壁、开元寺东壁、广东东壁、先锋四号。品种群Ⅳ：和路广眼（23）、和路广眼（24）。品种群Ⅴ：泰-1。品种群Ⅵ：驼背木、白花木、沙梨木。品种群Ⅶ：鸡卵眼。品种群Ⅷ：毛叶大果。品种群Ⅸ：早熟一号。品种群Ⅹ：青桥柴螺、青桥水柜。品种群Ⅺ：赐合种。 供试各品种多态性比例介于0.2703和0.4955间。表明在分子水平上，龙眼品种（系）之间的遗传多样性不如形态学性状所体现的那样丰富。本研究结果可以作为龙眼分类的依据和基础。 5、荔枝、龙眼、香蕉分子标记标准图谱的建立与品种鉴别 （1）建立起39个荔枝、46个龙眼、67个香蕉品种（系）的分子标记标准图谱，为准确进行荔枝、龙眼、香蕉品种鉴别提供了基础。 （2）应用AFLP技术对来自2个不同地方的2个荔枝品种（桂味、妃子笑）进行了鉴别。对龙眼的鉴别结果表明：福建东壁与广东东壁应为同一品种的不同品系；双孖木与青皮应为不同的品种；迟龙眼为水眼的变异系；早熟一号为一个新的品系。鉴别了3个引自不同国家的香蕉品种；几内亚、苹果以及阳江矮实际上为同一个香牙蕉品种。 （3）为配合品种认定工作，对仙婆果荔枝、红绣球荔枝、双肩玉荷包荔枝、春甜桔大果新株系进行了AFLP鉴定。 荔枝起源于中国，种质资源丰富，然而对荔枝品种的分类则只是根据果实龟裂片隆起类型大致分为三类，一直未能建立起科学、有效的分类体系；有关香蕉植物的分类过去一直沿用Simmonds的形态学分类方法，只能将栽培品种大致分为八大类型，到目前为止，对香蕉植物的分类还只能达到种或群的水平，对香蕉栽培品种间的亲缘关系等都未能深入研究；龙眼（Dimocarpus longan Lour.）起源于我国南部及越南北部。我国龙眼种质资源丰富，龙眼的分类涉及了形态学、孢粉学、生物化学、分子生物学等领域，经历了从形态多样性到DNA多样性的发展过程。由于分类标准不统一、分类手段的局限性，导致分类结果不一致。龙眼物种本身由于长期的自然杂交，种间类型多，部分品种来源不清，品种亲缘关系不明，同物异名及同名异物现象十分普遍，不利于龙眼种质资源的研究和品种选育与推广。此外，由于长期的引种交流，导致一些荔枝、龙眼、香蕉品种名称混乱。 本研究从分子水平上研究荔枝、龙眼、香蕉种质资源的遗传多样性，初步建立起荔枝、龙眼、香蕉的分子标记标准图谱，为更有效的保存和利用荔枝、龙眼、香蕉种质资源及品种的登记、保护、鉴定等提供了技术支持和理论依据。