本发明属于农业微生物基因工程技术领域,具体涉及一种抗草甘膦5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分离鉴定,所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述,该基因编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO:2所述。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因是根据Genbank中报导的放线细菌Isoptericola Variabilis的aroA基因序列合成得到,包含该基因质粒的重组大肠杆菌LZD002保藏在中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC NO:M2013632。经过生物学实验验证,证明该基因对草甘膦具有一定的耐受性。