本发明提供了一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法。所述方法是通过囊胚注射ES细胞制备定点整合1.3拷贝C基因型乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)转基因小鼠。首先构建定点整合1.3拷贝C型HBV的表达载体,然后采用电转导转化方法把重组质粒转化到ES细胞中,经过筛选和培养后获得定点整合重组的ES细胞,再把定点整合重组的ES细胞经消化成单个细胞后注射到囊胚中,然后把囊胚移植到假孕母鼠子宫中。该方法在国内外率先建立了1.3拷贝C型HBV的转基因小鼠,针对性的应用于乙肝相关研究领域中,为我国乙型肝炎预防和治疗研究更加理想的动物模型。