本发明属于分子细胞遗传学领域,具体涉及一种鉴别棉花D genome或D sub-genome全套染色体的方法。所述方法包括以SEQ ID No.1所示序列作为探针对棉花基因组DNA进行荧光原位杂交的步骤。以该段序列为探针,以陆地棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉的有丝分裂中期染色体为靶DNA,做荧光原位杂交,结果显示在陆地棉的D亚基因组染色体和雷蒙德氏棉的D基因组染色体上均表现出明显杂交信号,且信号分布在所有染色体上,而在陆地棉的A亚基因组染色体和亚洲棉的A基因组染色体均无明显信号。利用本发明中的序列采用FISH方法,可快速鉴别棉花D基因组或D亚基因组全套染色体。