本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法,1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法,包括以下步骤:获取VP4目的片段;构建重组表达质粒pET-32c-VP4;制备VP4重组蛋白。本发明成功构建了重组原核表达质粒,成功获得VP4重组蛋白可溶性表达,并且与兔抗DHAV-1血清具有良好的反应原性,说明DHAV-1的VP4蛋白成功获得了原核表达,建立了检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒,为DHAV-1抗体的检测及进一步开展DHAV-1的相关研究提供试验数据和基础材料。