本发明属于转基因检测技术领域,公开了一种检测转基因油菜转化载体的五重PCR引物及方法,所述检测转基因油菜转化载体的五重PCR引物的序列为:SEQ ID NO:1;SEQ ID NO:2;SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:5;SEQ ID NO:6;SEQ ID NO:7;SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:9;SEQ ID NO:10;同时公开一种检测方法。本发明采用琼脂糖凝胶电泳进行结果分析,琼脂糖凝胶电泳操作简单、经济,不需要昂贵的仪器设备,而且只需要一次电泳分析即可得知是否含有上述四种转基因油菜。