本发明提供了一种表达禽4型腺病毒fiber2蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。本发明中还提供了一种靶向ETH_00026625基因的sgRNA,所述靶向ETH_00026625基因的sgRNA核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列。所述靶向ETH_00026625基因的sgRNA特异性强,脱靶率低,与Cas9核酸酶配合,可实现在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00026625基因上插入fiber2基因。本发明所述重组球虫载体能表达fiber2蛋白和荧光标签蛋白,所述重组球虫载体预期可用于研发同时预防禽4型腺病毒和柔嫩艾美耳球虫的球虫疫苗,其免疫效果更为高效安全。