本发明公开了一种基于痘苗病毒天坛株的新型溶瘤病毒及其制备方法和应用,所述病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)区包含SEQ ID NO.1所示AIF‑GM‑CSF的编码序列。本发明将基因治疗的抑瘤效果与病毒治疗的溶瘤效应有效结合起来,制备了一种可高效表达人源AIF‑GM‑CSF基因的溶瘤痘苗病毒。在痘苗病毒天坛株溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时,大量表达人的AIF,可使感染的肿瘤细胞大量凋亡;并且大量表达人多GM‑CSF,可招募NK细胞或者DC细胞进入肿瘤内部,杀伤肿瘤或者将肿瘤抗原进行有效提呈,促进杀伤性T细胞的增值分化,发挥多重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者病毒疗法,增强了其对恶性肿瘤的杀伤能力。