本发明提供了一种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法,该方法包括:(1)将待测棉花植株的种子用浸种液浸泡;(2)将浸泡后的种子种植于病圃中;(3)选择能够在病圃中存活的棉花植株作为初筛棉花植株;(4)分别使用第一引物对和第二引物对初筛棉花植株的基因组DNA进行PCR扩增,得到第一扩增产物和第二扩增产物;第一引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,第二引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;如果第一扩增产物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且第二扩增产物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸,则指示待测棉花植株为抗黄萎病植株。本发明对黄萎病菌的抗性进行预测和筛选,淘汰病圃筛选过程中虽不发病但仍为感病的植株,减少人力物力的浪费,提高育种效率。