本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻S5位点杂种胚囊育性基因ORF3的分离克隆、功能验证及在水稻品种改良中的应用。ORF3编码Hsp70类蛋白,参与细胞蛋白质折叠和转移、胁迫信号转导等功能。该基因的不同等位基因在编码区有一个13bp的插入/缺失变异,且显性等位基因ORF3+比隐性等位基因ORF3-多13bp。ORF3-等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,ORF3+等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。在S5籼/粳杂合的水稻杂种中显性的ORF3+等位基因可以保护雌配子,从而提高籼粳杂交水稻的结实率,对水稻籼粳亚种间杂种优势利用具有重要意义。