本发明公开了恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其应用，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：SEQ ID NOs：任何一个所示的核苷酸序列，与核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；与核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；由SEQ ID NOs：4、5选择性剪切、选择不同转录起始位点或转录终止位点而生成的与SEQ ID NOs 4、5不同的其他核苷酸序列；本发明确定了玉米C型胞质不育核恢复基因Rf5的核苷酸及氨基酸序列。利用本发明的序列，可方便玉米杂交种三系配套材料创制，缩短选育周期，降低选育成本，提高种子生产效率。
