本发明公开了一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒以及PCR-RFLP检测方法,包括:引物对,上游引物,其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列;下游引物,其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。含有所述引物对的试剂盒还包括,PCR常规试剂,TaqDNA聚合酶,10×PCR缓冲液,dNTPs;酶切试剂,10×buffer,酶切缓冲液,EcoRI限制性内切酶以及使用所述引物对、所述试剂盒用于区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法。本发明方法操作简单,在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条或肌肉,快速准确的进行鱼种的鉴别,增加了鉴定结果的准确性和可信度,极大提高了工作效率。