本发明涉及植物抗病毒基因工程领域,公开了一种高效产生siRNA的马铃薯Y病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。高效产生siRNA的马铃薯Y病毒基因片段包括PVY1片段、PVY2片段和PVY3片段中的至少一种,PVY1片段、PVY2片段和PVY3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示,所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础,TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对马铃薯Y病毒产生交叉保护的有效基因片段,所述的有效基因片段包括可产生siRNA的马铃薯Y病毒基因片段。本发明的抗马铃薯Y病毒的弱毒疫苗作用稳定,可以起到有效的交叉保护作用,显著减轻植物受马铃薯Y病毒强毒株系感染后的伤害,延迟植物发病,大大减少损失。