本发明属于动物基因工程领域。从猪基因组中克隆了一个猪骨骼肌特异表达基因上游七个不同长度的启动子Six1-P、P1、P2、P3、P4、P5与P6,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1;2;3;4;5;6;和7所示,序列长分别为1692、180、530、844、1143、1135和1494bp。对猪Six1基因不同长度的启动子片段在三种真核细胞中的活性分析表明,猪Six1基因的启动子是一个肌肉特异性的启动子,除P1启动子外其它几个启动子P2、P3、P4、P5与P6均具有启动基因表达的能力,并且在P2、P3、P4、P5与P6这5个启动子中,除P2外,其它几个启动子均表现出肌肉特异性。本发明公开了这七个启动子及其相应表达载体的制备方法,以及利用双荧光素酶报告系统对猪Six1基因启动子活性的鉴定。