本发明公开了一种截短型丙型肝炎病毒HCV NS3抗原,是HCV基因组中NS3全长基因编码的第1252~1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,对应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述HCV NS3重组抗原蛋白制备方法是:构建用于表达截短型丙型肝炎病毒HCV NS3抗原的大肠杆菌优化密码子,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,将所述密码子基因片段经双酶切,再与经同样酶切后的表达载体连接,获得重组表达质粒,以常规方法使抗原表达,经纯化获得。本发明的抗原蛋白灵敏度高、特异性强,用其检测HCV抗体,与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高达97%。预示该抗原可以应用于多克隆或单克隆抗体、丙型肝炎病毒检测试剂盒的制备,具有良好的临床应用前景。