本发明涉及检测人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。所述试纸通过双抗体夹心法检测人ApoE-ε4蛋白,所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体作为捕获抗体,所述第一ApoE-ε4单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者;并且所述双抗体夹心法采用第二ApoE-ε4单克隆抗体作为检测抗体,所述第二ApoE-ε4单克隆抗体来源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本发明的荧光免疫层析试纸操作简便、快速、检测范围宽、特异性高、灵敏度好。