本发明公开了一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用,所述ES‑2‑AF肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示;所述ES‑2‑AF肽的透明质酸化修饰物是由上述的ES‑2‑AF肽的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合而成,结构式为:HA‑CO‑NH‑(ES‑2‑AF)n。本发明的ES‑2‑AF肽与Anti‑flt1肽、ES2肽相比,保留甚至增强了抑制新生血管生成的能力。本发明的ES‑2‑AF肽的透明质酸化修饰物与ES‑2‑AF肽相比,保留了ES‑2‑AF肽抗新生血管生成与抗肿瘤活性,整合了大分子透明质酸抗新生血管生成等特性,使其具有稳定性更高、亲水性更强、靶向性更强等特性,因此具有更好的使用效果和应用价值。