本发明提供了检测牛腺病毒试剂盒及其应用,属于PCR检测技术领域。本发明首先通过对牛腺病毒基因组序列的比对,确定了在牛腺病毒各个血清型均保守的区域,并以该保守区为靶序列设计了用于检测牛腺病毒多有血清型的引物对和探针,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3所示,本发明还提供了对牛腺病毒进行实时荧光定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测试剂盒具有检测准确,灵敏度高、特异性强,简便快速的优点,能够对各个血清型的牛腺病毒进行定量检测,且成本低廉,既可用于临床检测也可用于生物制品的质量控制,具有良好的经济价值和应用前景。