本发明公开了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其应用。本发明的真核表达单链抗体至少具有由如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL和如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL‑Linker‑VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL‑Linker‑VH。将该片段的编码基因插入真核表达载体,构建成单链抗体真核表达质粒pcDNA3.1‑scFv后,将该pcDNA3.1‑scFv直接注射小鼠乳腺组织,能显著提高细胞因子IFN‑γ和IL‑4的含量(P<0.05),降低炎症因子TNF‑α的含量(P<0.05),维持乳腺结构的相对完整,减少炎性细胞的浸润,对小鼠提供一定的保护作用。