本发明公开了一种矮牵牛花药发育相关PhDof4基因及其应用,属于植物基因工程技术领域。本发明公开的矮牵牛Dof基因家族成员PhDof4基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。构建PhDof4基因的RNAi表达载体转化矮牵牛,能使转基因植株矮化、花期提前、花药发育不正常,表明PhDof4是调控矮牵牛花药生长发育重要基因。本发明还公开了该基因的花药育性调控的基因工程改良方法,该方法能为进一步研究矮牵牛花药发育的分子机制提供参考,对雄性不育基因工程、矮牵牛杂交育种、杂种优势利用、品种生产都具有实际应用价值。