本发明涉及利用RFLP技术鉴定棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记的方法,包括步骤:a)利用同核异质系:细胞质雄性不育系P30A、保持系P30B、恢复系Y18R与其他棉花品种进行杂交,产生衍生系;b)用CTAB法提取不育系、保持系、恢复系及衍生系的叶片总DNA;c)RFLP分析,并对RFLP片段进行克隆和测序;d)将RFLP标记向SCAR标记转化;e)数据分析。本发明公开了棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记,所述分子标记分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列以及棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记在棉花育种特别是“三系”杂交棉育种中的应用。