本发明公开了二次生料发酵制备富含共轭亚油酸豆粕饲料的方法,包括以下步骤:(1)先将产朊假丝酵母ANY01(Candida utilis ANY01)和植物乳酸菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)分别通过斜面固体培养,连续活化2次,再摇瓶液体培养,连续活化2次,扩培,分别制备好发酵种子液;(2)再将豆粕粉碎,过筛,添加麸皮、磷盐、钾盐、镁盐和去离子水,接种产朊假丝酵母ANY01,调节pH、控温、发酵后,再添加麸皮、磷盐、钾盐、镁盐、氯化钠、微量元素锰、植物油脂和去离子水,接种植物乳酸菌ANCLA01,调节pH、控温发酵。本发明采用二次生料发酵方法制备富含共轭亚油酸豆粕饲料,经二次发酵后豆粕饲料的总蛋白含量提高约3个百分点左右,并且具有浓厚的酒酸香味,适口性好,对畜禽有明显的诱食性。