本发明涉及一种同时检测烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒四种中一种或多种大豆病毒病害的简单、快速、特异、灵敏的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。所述实时荧光PCR检测方法使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的引物序列和SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12中的寡核苷酸探针。本发明的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。