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一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用
- 专利权人:
- 中山大学
- 发明人:
- 李石竹,卢建国,方文宇
- 申请号：
- CN201910878588.3
- 公开号：
- CN110923229A
- 申请日:
- 2019.18.09
- 申请国别(地区):
- CN
- 年份:
- 2020
- 代理人:
- 摘要：
- 本发明公开了一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统,所述CRISPR/Cas9系统包括以下步骤:(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上,靶位点2设计在第三外显子上;(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性,用dmrt1 E1 F和dmrt1 E1 R扩增靶位点1及附近序列,用dmrt1 E3 F和dmrt1 E3 R扩增靶位点2及附近序列;(3)以pUC19‑gRNA‑scaffold质粒为模板,用dmrt1 E1 gRNA F和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增,用dmrt1 E3 gRNA F和gRNA R进行gRNA2片段的PCR扩增;以上述PCR产物为模板,体外转录并纯化获得gRNA;(4)以pXT7‑hCas9线性化质粒为模板,体外转录合成Cas9 mRNA;(5)将Cas9 mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中;(6)检测突变类型,计算基因编辑率。
- 来源网站：
- 中国工程科技知识中心
- 来源网址：
- http://www.ckcest.cn/home/
