本发明提供了一种棉花启动子GbU6‑5PS及应用,该棉花启动子GbU6‑5PS的正反链如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示,该启动子通过第一轮PCR扩增获得覆盖全长GbU6‑5启动子序列的片段,然后通过第二步进行第二轮PCR扩增,以GbU6‑5P为供体质粒模板,以AtU6‑26SK为受体质粒模板,采用Transfer PCR方法对GbU6‑5P启动子进行截短克隆得到。本发明的棉花启动子GbU6‑5PS不仅适合用于棉花,而且片段很短,长度只有105bp,符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,能显著提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。