本发明属于生物工程制药、蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域,涉及对人类表皮生长因子受体EGFR1和HER2均具有高亲和力的小型化融合抗体的设计、构建及其在肿瘤靶向诊断和治疗中的应用。该双特异性抗体由HER2特异性结构域和EGFR1特异性结构域通过(G4S)3连接肽串联后经基因重组表达获得,融合蛋白编码基因全长为804bp,编码268个氨基酸,融合蛋白分子量为29kD,其氨基酸序列为SEQ ID No:1所示序列。本发明的双特异性小型化抗体相较于EGFR1和HER2抗体联合使用有显著的体内外活性优势,且具有低毒性、非肿瘤部位体内清除快速等优点,在靶向诊断和治疗中均具有高效率,可用于肿瘤诊断和治疗中。