本发明提供了一种基于分子生物学的泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物和鉴别方法,其特点是:设计了特定引物序列:上游引物序列为:5'-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3'(SEQ ID NO.1所示);下游引物序列为:5'-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3'(SEQ ID NO.2所示)。鉴别方法:采用常规方法提取泥鳅或大鳞副泥鳅样品的DNA;进行PCR扩增;PCR扩增结束后,取适量扩增产物进行凝胶电泳检测,确定扩增片段大小,进行鉴别。鉴别方法准确、高效。本发明解决了传统的形态学区分法操作困难、分辨成功率低的问题。特别在仔、稚鱼阶段泥鳅和大鳞副泥鳅很难从外形上分辨,本发明可提供一种方便、准确的鉴别方法。