本发明公开了一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体、制备方法及其应用,属于生物医学及基因工程抗体技术领域,包括重链可变区和轻链可变区;所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;该抗体的编码DNA,包括重链可变区和轻链可变区;所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO.1所示;所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:3所示。本发明通过EBV病毒将B细胞永生化,结合有限稀释法筛选天然全人源乙肝病毒单克隆抗体的方法,该筛选方法无需大型昂贵仪器,简单易行,适于在常规生物实验室进行开展。