The present invention provides agkistrodon acutus hemocoagulase-B. The agkistrodon acutus hemocoagulase-B is high-activity hemocoagulase separated from agkistrodon acutus venom. The hemocoagulase is a single-stranded glycoprotein comprising 236 amino acids, and has an amino acid sequence shown as SEQ ID No. 1. The strand comprises 6 pairs of disulfide bonds； the molecular weight of SDS-PAGE is approximately 35kD； the molecular weight after deglycosylation is 26116.7Da； and an isoelectric point (pI) is 6.0. A hemocoagulase molecule is modified by heterozygotic polysaccharides at an Asn 77, 100, 229 site. The hemocoagulase is serine proteinase. The present invention further provides a separation and purification method of the hemocoagulase. The method comprise: removing undissolved substances by using pretreatment； performing anion-exchange column chromatography for two times and Sephdex-G75 molecular sieve chromatography for one time； obtaining an active elution peak； performing dialysis and lyophilization, so as to obtain the high-purity agkistrodon acutus venom hemocoagulase. The activity of the agkistrodon acutus venom hemocoagulase is not less than 2000U/mg； the purity in the HPLC analysis can exceed 95%； and the yield is 0.25% to 0.30% calculated according to the weight of an agkistrodon acutus venom raw material.La présente invention concerne l'hémocoagulase-B d'agkistrodon acutus. L'hémocoagulase-B d'agkistrodon acutus est une hémocoagulase de grande activité séparée du venin d'agkistrodon acutus. L'hémocoagulase est une glycoprotéine simple brin comprenant 236 acides aminés, et a une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID No. 1. Le brin comprend 6 paires de liaisons disulfure ； le poids moléculaire de SDS-PAGE est d'environ 35 kD ； le poids moléculaire après déglycosylation est de 26 116,7 Da ； et un point isoélectrique (pI) est de 6,0. Une molécule d'hémocoagulase est modifiée par des polysaccharides hétérozygotes au niveau d'un site Asn77, 100, 229
