本发明公开了一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用,属于分子育种技术领域。用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3‑F和Yinhui3‑R,Yinhui3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,Yinhui3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;通过引物对能够同时特异性扩增出91bp序列和85bp序列的杂交F1单株则为真杂交种,缺少上述任意一条的杂交F1单株则为假杂交种。本发明还提供了一种南瓜杂交种子纯度的鉴定方法。本发明开发的SSR分子标记及引物具有较高稳定性,可以简便、快速地应用于印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记辅助育种筛选。