本发明提供了一种鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的检测试剂与方法,属动物病原检测领域。本发明的检测试剂含有SEQ ID NO.1~4所述的2个引物对和SEQ ID NO.5~6所述的探针。本发明还提供了通过上述检测试剂鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的方法,经过一个二重荧光定量PCR反应可同时鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株,可以用于大批量样品的高通量检测,同时具有快速、特异、敏感、准确、简便的特点,本发明为猪伪狂犬病传染源调查、传播环境、病原追溯提供了有效工具,对猪伪狂犬病的防控具有较好的应用价值。