本发明公开了一种抗O型口蹄疫病毒特异性单域抗体及其重组表达载体,该抗O型口蹄疫病毒特异性单域抗体具有核苷酸序列:SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2。本发明以O型口蹄疫病毒灭活疫苗免疫双峰驼,利用噬菌体展示技术建立抗FMDV O型 VHH免疫抗体库,以重组VP1蛋白作为筛选用抗原,通过3轮高强度淘洗,筛选得到与VP1抗原亲和力强的2株特异性抗FMDV 血清O型的重链抗体序列,并将其分别克隆到原核表达载体中,在E.coli中完成了可溶性表达,亲和层析纯化的VHH抗体蛋白能够特异性的同O型FMDV全病毒抗原和重组VP1蛋白特异性相互作用,与FMD病毒Asia 1和A型不发生交叉反应,具备了同常规IgG抗体相同的生物学功能。