本发明涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0585c及其T细胞表位肽在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用,所述表位肽选自P24、P26和P31,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明利用结核分枝杆菌Rv0585c蛋白抗原及其T细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应,与以往采用完全抗原相比,能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。由所述Rv0585c蛋白抗原及其表位肽制备的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。Rv0585c蛋白抗原及其T细胞表位肽制备的结核疫苗和抗结核药物可用于结核病的预防和治疗。