本发明公开了一种无乳链球菌的检测引物组，包括引物对hylB、引物对ponA和引物对cfb；其中，所述引物对hylB 包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物hylB‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物hylB‑R；所述引物对ponA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物ponA‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物ponA‑R；所述引物对cfb包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物cfb‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物cfb‑R。本发明还公开了包含所述引物组的检测试剂盒和使用所述检测试剂盒的多重PCR检测方法本发明特异性好、灵敏度高、简单快速、高效精准，适用于无公害水产品中无乳链球菌的快速检验检疫，可直接应用于水产养殖病害的早期监测和预警。检测无乳链球菌DNA的最低浓度为7.74×10‑3 ng/ uL，不需经过细菌培养，检测所需样品量少，可实现微创取样。
