本发明提供一种编码马尔堡病毒包膜糖蛋白的核苷酸序列,所述核酸序列如SEQ ID NO:1所示,本发明还公开了能够表达该核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒及其制备方法以及在制备预防马尔堡病毒病疫苗中的应用。所述疫苗以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系,携带的保护性抗原基因是密码子优化后的马尔堡病毒Angola株包膜糖蛋白基因。包膜糖蛋白基因经密码子优化后,在转染细胞中可检测到包膜糖蛋白的显著表达。该重组疫苗免疫动物后,能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应,具有良好的免疫保护效果。该疫苗制备方法简单,可在短期内大规模生产,用于应对突发马尔堡病毒疫情和生物恐怖袭击。