本发明涉及动物医药工程技术领域,提供了一种真核表达载体,由含有牛β-防御素5成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD5,牛β-防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;还提供了一种重组菌株;还提供了一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法,包括1)牛β-防御素5成熟肽基因的制备;2)上述真核表达载体的构建;3)上述重组菌株的制备;4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。本发明所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素5成熟肽具有抗菌活性,且有一定的抗结核活性,适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用,而且生产成本低、生产效率高。