本发明提供了检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的RT‑PCR及其应用,属于PCR检测技术领域。本发明通过对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒基因组序列的比对,确定保守区靶序列,设计用于检测二者的特异性引物对,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示,本发明还提供了对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确,灵敏度高、特异性强,简便快速的优点,能够实现对作物感染水稻黑条矮缩病毒或南方水稻黑条矮缩病毒进行区分,且成本低廉,具有良好的经济价值和应用前景。