本发明公开了重组猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明首先公开了重组猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体,其重链的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示,轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明还公开了稳定表达重组猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体的悬浮HEK293细胞系。本发明通过将重组猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体的重链和轻链编码基因克隆至真核表达载体,利用悬浮HEK293细胞实现重组猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体的稳定和高效表达。本发明所述重组猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体具有良好的反应原性和中和活性,在开发新型猪瘟病毒诊断和治疗制剂中具有重要应用价值。