本发明提供了一种筛选抗TMV烟草品种的引物及其方法和试剂盒,该引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。通过PCR扩增反应检测N基因或CN基因两个抗性基因;若有613bp条带,则该检测品种具有TMV抗性;若无613bp条带,则该品种不具TMV抗性。本发明的试剂盒含上下游引物、2×PCR缓冲液和ddH2O;所述引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明检测两个基因的方法较单个基因检测具有较少操作步骤,节省材料、试剂,进而达到快速、成本低的优势;另外可以避免单基因检测而漏掉另外的抗性基因。