本发明属于两系杂交水稻育种中的分子标记辅助选择与种子纯度检测技术领域,特别涉及一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性分子标记及其应用。一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性标记,该特异性标记引物选自:核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。本发明根据引起水稻温敏核不育基因tms5功能变化的单碱基突变(C-A),设计了一系列能特异扩增野生型C和突变型A的引物,并在3’端位置引入错配碱基,利用限制性内切酶对PCR产物酶切,将野生型和突变型准确的区分开。