本发明涉及一种估算烟草N导入片段右端长度的分子标记、引物及方法。该分子标记为Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列。本发明估算方法是以TN5.51引物对或TN5.34引物对为引物以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增,然后电泳检测,如扩增出对应大小的DNA片段,则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Coker176相当;如没有扩增出,则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Coker176短。该方法可以简便、快速、高通量地应用于烟草TMV抗病基因定位和选育烟草抗TMV品种中,有利于减少与N基因连锁的累赘。