本发明公开了一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用,属于基因工程领域。该表达载体是在pCAT3-control载体骨架上含有β-珠蛋白MAR序列、β-干扰素MAR序列、多克隆位点及真核抗性基因选择复合体;β-干扰素MAR序列位于pCAT3-control载体骨架上SV40 启动子上游,β-珠蛋白MAR序列位于pCAT3-control载体骨架上SV40 late poly A region下游。所述β-珠蛋白MAR序列的GenBank编号为:L22754.1,β-干扰素MAR序列的 GenBank编号为:M83137.1。本发明的载体适用于在人类及哺乳动物细胞中高效表达外源基因。