本发明一种鸭腺病毒2型DNA疫苗及其制备方法和应用,属于免疫学技术领域。所述制备方法包括:合成如SEQ ID NO.3所示的DAV‑hexon序列;构建pcDNA3.1‑DAV‑hexon质粒;pcDNA3.1‑DAV‑hexon质粒转染293T细胞,在293T细胞中表达得到hexon蛋白即鸭腺病毒2型DNA疫苗。所述鸭腺病毒2型DNA疫苗由上述制备方法制得。所述鸭腺病毒2型DNA疫苗在制备预防鸭腺病毒2型疫病疫苗中的应用。本发明具有以下优点:SEQ ID NO.3所示的DAV‑hexon序列有利于抗原蛋白的表达;更能提高hexon的表达量;可对番鸭提供80%‑90%的攻毒保护。