本发明公开了一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用。Fab抗体包括轻链和重链,所述重链具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列;所述轻链具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。本发明提供的Fab抗体与抗原的结合可被游离的半抗原竞争性抑制,IC50为135.7ng/mL,具有很好的抗原结合活性。通过标准曲线可知线性检测范围分别在7.2~861.7 ng/mL之间。