本发明涉及烟草花叶病毒(TMV)抗性基因N'au的分离克隆与育种应用。本发明公开了烟草抗TMV基因N'au的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的多肽的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。将种质资源包含的N'au基因通过常规育种手段转育至感TMV主栽烟草品种中,可得到非转基因抗TMV烟草品种。本发明的N'au基因在主栽烟草品种中具有核苷酸一致率高的同源序列,因此常规育种容易获得较短的携带N'au基因的渐渗片段单株,从而获得连锁累赘较小的抗TMV品种。该基因能同时抗TMV的U1和Cg株系,本发明所述的新抗病基因N'au对于培育抗TMV烟草具有重大应用前景。