本发明提供检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒,其采用16s rRNA基因序列为设计引物,上游引物:5’-ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3’;下游引物:5’-GCGGTCTACTTAATCCGT-3’。本发明基于16s rRNA基因建立了鉴定犬猫钩端螺旋体的SYBR Green I荧光定量PCR方法。在最佳反应条件下反应效率为0.98,获得的标准曲线相关系数R值达1.000,标准曲线的线性范围达到1~1×107拷贝8个数量级,最低可检测到约1个目的拷贝,即1.2fg DNA。本发明建立的SYBR Green I荧光定量方法具有特异性强、灵敏度高、定量范围广的特点。