本发明公开了一种水稻抗除草剂蛋白与基因及其应用,所述抗除草剂蛋白由如SEQ ID NO.1所示的水稻乙酰乳酸合成酶蛋白氨基酸序列中Ala179和/或Gly628突变后得到;或者,由如SEQ ID NO.1所示的水稻乙酰乳酸合成酶蛋白氨基酸序列中Ser627和Val643突变后得到;所述基因编码所述抗除草剂蛋白的基因;以及所述的抗除草剂蛋白和/或编码抗除草剂蛋白的基因在制备抗除草剂植物中的应用。本公开提供的抗除草剂蛋白、基因以及应用使种植禾本科植物农作物过程中可以使用乙酰乳酸合成酶抑制类除草剂,满足禾本科植物直播、混播、移栽及机械化生产等需求,具有很好的应用前景。